手把手教學(xué)

 

 

        培養(yǎng)操作關(guān)鍵步驟

【培養(yǎng)體系】：DMEM/F12(CellCook cat:CM2012,或同配方)+10%胎牛血清(CellCook cat:CM1002L,或更高級別)；配套即用型完培（CellCook cat:CC2101S / CC2101M）

【傳代比例】：1:2傳代（培養(yǎng)面積比）

【換液頻率】：2-3天換液一次

【倍增時間】：50-60 hours（DSMZ）

【環(huán)境參數(shù)】：37℃、5% CO?飽和濕度培養(yǎng)箱，pH維持在7.2-7.4

? Step 1：當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)80%時傳代，該細(xì)胞為貼壁懸浮混合細(xì)胞，懸浮細(xì)胞是活細(xì)胞，可先將懸浮部分吸出收集到離心管中；

? Step 2：用0.25%含EDTA胰酶置于 37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘（鏡下觀察細(xì)胞變圓、間隙增大），待細(xì)胞變圓收縮成流沙狀態(tài)脫落后加入含血清培養(yǎng)基終止消化，將消化下來的細(xì)胞一起收集到上述離心管中；

? Step 3：1000rpm離心5分鐘，重懸后按1:2比例接種至新培養(yǎng)瓶。

【凍存】：

1、細(xì)胞匯合度80%以上，活力狀態(tài)較好時，可消化收集細(xì)胞沉淀進(jìn)行凍存。

2、細(xì)胞沉淀用適量 4 °C 凍存液（DMEM/F12(含10%FBS)+10%DMSO）重懸， 一瓶 T25 細(xì)胞凍存一管（1ml/管），梯度降溫（4℃ 30分鐘→-20℃ 1小時→-80℃過夜→液氮長期保存）或使用程序降溫盒降溫后再轉(zhuǎn)移至液氮中保存。凍存管需標(biāo)記細(xì)胞名稱、代次、凍存日期。

若使用無血清凍存液可省去程序降溫步驟，直接轉(zhuǎn)入-80℃保存，但仍建議在-80℃放置24小時后再轉(zhuǎn)移至液氮。

無血清凍存液使用方法與使用效果參考下文鏈接→

《無血清凍存液PK常規(guī)凍存液》

【復(fù)蘇】：

1.液氮取出的細(xì)胞放入干冰或液氮中轉(zhuǎn)移到細(xì)胞房，提前準(zhǔn)備好相關(guān)試劑耗材。

2.取出凍存管置于室溫?fù)]發(fā)液氮30s（如放入干冰轉(zhuǎn)移則不需要揮發(fā)液氮），再轉(zhuǎn)移到 37 °C 水浴中迅速解凍（1分鐘內(nèi)）。為了減少污染的可能性，保持凍存管瓶蓋在水浴液面之上。 一旦大部分內(nèi)容物解凍，立即將凍管移出水浴，70%的乙醇消毒凍存管外壁。

3.將含細(xì)胞的凍存液轉(zhuǎn)移到含 4-6mL完全培養(yǎng)基的離心管中，輕輕混勻，1000rpm離心5min去除DMSO ，重懸后接種（建議每個 T25 培養(yǎng)瓶添加 6-8ml 完全培養(yǎng)基）轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中靜置培養(yǎng)，24小時后更換培養(yǎng)基（去除死亡細(xì)胞）。復(fù)蘇后24小時內(nèi)避免移動培養(yǎng)瓶，以促進(jìn)貼壁。

避坑指南

 

 

培養(yǎng)經(jīng)驗要點      

 

 

 

1. 該細(xì)胞增殖較緩慢，喜歡聚團(tuán)生長，培養(yǎng)中對數(shù)生長期細(xì)胞倍增時間為48-72小時（按1:2傳3-4天可傳一次）；細(xì)胞傳代時比例不宜太高，培養(yǎng)密度不宜太低，一般1:2或1:3傳代較為合適，培養(yǎng)密度越低增殖速度越慢，細(xì)胞團(tuán)在傳代時需要吹散；細(xì)胞密度越高，培養(yǎng)基消耗越快，代謝廢物積累會導(dǎo)致pH下降（培養(yǎng)基變黃），需注意及時換液（2-3天/次）或傳代。

2. 剛接種時呈懸浮圓形，24小時內(nèi)貼壁，48小時后伸展為多邊形或短梭形； 匯合度過高（>90%）時，細(xì)胞會堆疊生長，邊緣細(xì)胞形態(tài)拉長，易脫離基質(zhì)；低血清環(huán)境（<5% FBS）下，細(xì)胞增殖減緩，部分會自發(fā)長出短突起，類似早期分化狀態(tài)。

3. SH-SY5Y屬于半貼壁細(xì)胞，貼壁能力中等，傳代后若貼壁率低（<50%），可能提示細(xì)胞活力下降或培養(yǎng)表面不適合。

 

4. 對環(huán)境敏感，溫度波動超過±1℃可能會導(dǎo)致細(xì)胞皺縮或脫落。CO?濃度不足會使培養(yǎng)基pH升高（變紫），細(xì)胞生長停滯；濃度過高（>6%）則pH降低（變黃），易引發(fā)細(xì)胞凋亡。

5. 細(xì)胞傳代次數(shù)過多易出現(xiàn)表型漂移，表現(xiàn)為分化能力下降（突起變短、標(biāo)志物表達(dá)減少）、增殖速率異常，建議邊擴(kuò)培邊凍存保種，實驗盡量使用低代數(shù)細(xì)胞（前10代）。

常見問題解決方案

細(xì)胞狀態(tài)差（顆粒增多、空泡化）

       表現(xiàn)：細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量黑色顆?；虼笮〔坏鹊目张?，邊緣模糊，增殖減緩。

       常見原因：血清質(zhì)量差（含毒素或低活性）、凍存/復(fù)蘇過程損傷（DMSO濃度過高或復(fù)蘇溫度不當(dāng)）、消化過度或吹打過于劇烈、支原體污染（隱性感染，需通過PCR檢測確認(rèn)）。

       解決方案：更換優(yōu)質(zhì)血清，優(yōu)先選擇經(jīng)細(xì)胞活力驗證的批次；復(fù)蘇時37℃水浴快速解凍（1分鐘內(nèi)），離心去除DMSO，用預(yù)熱培養(yǎng)基重懸；適當(dāng)縮短控制消化時間，吹打操作輕柔一些；若確定支原體污染，可用支原體清除試劑（CellCook cat:ME01C）處理，或丟棄污染細(xì)胞（推薦，避免殘留影響）。

細(xì)胞抱團(tuán)生長

       表現(xiàn)：聚團(tuán)嚴(yán)重時細(xì)胞聚集形成大小不一的團(tuán)塊，貼壁細(xì)胞減少，懸浮細(xì)胞增多。

       常見原因：胰酶消化不充分（細(xì)胞間連接未斷開）、傳代時細(xì)胞團(tuán)未吹散分開、 培養(yǎng)基中鈣離子濃度異常（影響細(xì)胞間黏附）。

       解決方案：若細(xì)胞抱團(tuán)嚴(yán)重，可以使用0.125%的胰蛋白酶，能緩解細(xì)胞消化后聚團(tuán)的情況，消化時確保胰酶覆蓋所有細(xì)胞，鏡下觀察至細(xì)胞邊緣收縮、間隙明顯后終止，可視情況適當(dāng)延長消化時間；傳代時用移液管輕柔吹打10-15次（避免產(chǎn)生氣泡），使細(xì)胞團(tuán)分散為單個細(xì)胞，傳代后成團(tuán)難展開可先靜養(yǎng)幾天穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)再重新消化鋪板并將血清提高到15%。

細(xì)胞生長異常緩慢

       表現(xiàn)：細(xì)胞生長超過正常傳代周期仍未達(dá)到可傳代匯合度，細(xì)胞趨于生長停滯。

       原因：血清品質(zhì)較差或培養(yǎng)基變質(zhì)、培養(yǎng)環(huán)境不穩(wěn)定、傳代接種密度太低、消化過度操作損傷、聚團(tuán)嚴(yán)重等。

       解決：避免使用過期或反復(fù)凍融血清，使用新鮮配制完培；定期校準(zhǔn)培養(yǎng)箱，保證環(huán)境參數(shù)穩(wěn)定；根據(jù)細(xì)胞生長活力調(diào)整傳代比例，避免過度稀釋；注意操作要點。

培養(yǎng)基頻繁渾濁

       表現(xiàn)：換液后1-2天培養(yǎng)基變渾濁（顆粒狀或白色絮狀或云霧狀），伴隨細(xì)胞狀態(tài)變差甚至死亡。

       常見原因：操作污染（細(xì)菌或真菌污染，真菌可見菌絲）；培養(yǎng)箱污染（水箱或托盤長期未清潔，滋生微生物）；細(xì)胞自身凋亡過多（釋放細(xì)胞碎片導(dǎo)致渾濁）。

       解決方案：立即丟棄污染細(xì)胞，徹底消毒培養(yǎng)瓶/板及操作臺面，更換新培養(yǎng)基和試劑；每周清潔培養(yǎng)箱（用75%酒精擦拭內(nèi)壁，水箱添加抑菌劑）；若因凋亡導(dǎo)致，檢測細(xì)胞代數(shù)及培養(yǎng)條件，必要時復(fù)蘇低代次細(xì)胞。

文獻(xiàn)速遞

 

 

       研究方向與應(yīng)用

相關(guān)產(chǎn)品推薦

SH-SY5Y人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞（CellCook cat:CC2101）

SH-SY5Y配套即用型完培（CellCook cat:CC2101S / CC2101M）

DMEM/F12(CellCook cat:CM2012,或同配方)

胎牛血清(CellCook cat:CM1002L,或更高級別)

0.25%胰酶-EDTA溶液（CellCook cat:CM1006）

本文所述方法僅供參考，具體操作需結(jié)合實驗室條件優(yōu)化。

您在SH-SY5培養(yǎng)中遇到過哪些問題？歡迎留言討論！