A549細(xì)胞作為肺癌研究的"黃金模型"，你是否還在為細(xì)胞貼壁不良、形態(tài)異常而頭疼？本文不僅詳解培養(yǎng)規(guī)范與操作技巧，更匯總多篇CELLCOOK賽庫生物A549應(yīng)用文獻(xiàn)，助你輕松攻克實驗難題！
A549細(xì)胞特性
為什么成為肺癌研究首選？
【來源】：A549（RRID: CVCL_0023）人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系，源自58歲白人男性肺腺癌組織，1972年由Giard等建立。
【應(yīng)用領(lǐng)域】：KRAS通路研究、藥物篩選、腫瘤微環(huán)境模擬等。
核心特征
【形態(tài)】：貼壁生長，上皮樣多邊形，核質(zhì)比高，細(xì)胞排列緊密呈鋪路石樣，傳代后多數(shù)細(xì)胞 4–6 h 貼壁，24 h 伸展完全。
（來源：https://www.atcc.org/products/ccl-185 ）
左圖：賽庫生物 A549(200X)
右圖：賽庫生物 A549(100X）
【遺傳】：非整倍體核型，64-67條染色體（ATCC核型分析），攜帶KRAS G12S突變（Gly12Ser，c.34G>A），無EGFR敏感突變，是研究KRAS驅(qū)動型肺癌的理想模型。
（https://www.cellosaurus.org/CVCL_0023）
【功能】：可分泌癌胚抗原（CEA），表達(dá)上皮細(xì)胞標(biāo)志物（如CK18、E-鈣粘蛋白），具有一定的侵襲和遷移能力，對化療藥物（如順鉑）的敏感性存在劑量依賴性。
手把手教學(xué)
培養(yǎng)操作關(guān)鍵步驟
【培養(yǎng)基】：F-12K(CellCook cat:CM2004) + 10%胎牛血清(CellCook cat:CM1002L)，pH 7.2-7.4。實驗室無菌操作條件不足時可添加1%青霉素-鏈霉素（雙抗)。
【環(huán)境】：37℃、5% CO?飽和濕度培養(yǎng)箱，避免頻繁開關(guān)箱門溫濕度波動，影響細(xì)胞狀態(tài)！
【傳代時機(jī)】：細(xì)胞匯合度達(dá)80%時傳代（避免過密導(dǎo)致形態(tài)改變或傳代密度太低導(dǎo)致細(xì)胞生長遲滯），常規(guī)實驗推薦1:2-1:3（根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)調(diào)整），每2-3天傳代一次。
? Step 1：棄舊培養(yǎng)基，PBS（無鈣鎂）輕柔洗滌2次（去血清殘留，避免影響胰酶活性）。
? Step 2：0.25%胰酶-EDTA覆蓋細(xì)胞層，37℃消化2-3分鐘（鏡下見細(xì)胞變圓、間隙增大立即終止）。
? Step 3：加含血清培養(yǎng)基中和胰酶終止消化，輕柔吹打成單細(xì)胞懸液。（吹打時使用 10mL 移液管，輕柔吹打 5-8 次，避免產(chǎn)生氣泡）
? Step 4：離心（1000rpm, 5min） ，棄上清，重懸接種至新培養(yǎng)瓶，補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基。
【凍存】：對數(shù)期細(xì)胞+凍存液（F-12K（含 10 % FBS）+10 % DMSO），重懸（濃度1×10?-5×10? cells/mL），梯度降溫（4℃ 30分鐘→-20℃ 1小時→-80℃過夜→液氮長期保存）。凍存管需標(biāo)記細(xì)胞名稱、代次、凍存日期。
若使用無血清凍存液可省去程序降溫步驟，直接轉(zhuǎn)入-80℃保存，但仍建議在-80℃放置24小時后再轉(zhuǎn)移至液氮。
無血清凍存液使用方法與使用效果參考下文鏈接→
《無血清凍存液PK常規(guī)凍存液》
【復(fù)蘇】：液氮中取出凍存管，37℃水浴1分鐘內(nèi)解凍，無菌操作轉(zhuǎn)移至含預(yù)熱培養(yǎng)基的離心管，離心去DMSO，重懸后接種，24小時后更換培養(yǎng)基（去除死亡細(xì)胞）。復(fù)蘇后24小時內(nèi)避免移動培養(yǎng)瓶，以促進(jìn)貼壁
避坑指南
常見問題解決方案
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問題 |
可能原因 |
解決方案 |
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細(xì)胞貼壁不良 |
胰酶消化過度/FBS質(zhì)量差/培養(yǎng)瓶表面處理不足 |
嚴(yán)格控制消化時間/更換優(yōu)質(zhì)血清/推薦使用TC處理培養(yǎng)瓶以優(yōu)化貼壁效果 |
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形態(tài)異常 |
傳代過多/支原體污染/培養(yǎng)基營養(yǎng)不足 |
使用低代次細(xì)胞/支原體檢測/及時更換新鮮培養(yǎng)基。 |
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增殖緩慢 |
CO?濃度不足（pH偏高）/溫度過低/血清濃度不足 |
校準(zhǔn)培養(yǎng)箱/維持37℃恒溫/試調(diào)整FBS濃度至10%-15% |
關(guān)鍵注意事項
避免頻繁操作
反復(fù)洗滌或吹打會導(dǎo)致細(xì)胞活性下降，操作前規(guī)劃好步驟，保持2-3天傳代/換液處理一次的頻率。
污染防控
嚴(yán)格無菌操作，定期對培養(yǎng)箱、操作臺消毒，培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁或異常沉淀時及時確認(rèn)丟棄。注意 A549/HeLa、A549/HEK293 交叉污染案例，每半年或 10 代內(nèi)進(jìn)行一次 STR 鑒定。
代次管理
A549細(xì)胞傳代超過30代后可能出現(xiàn)基因漂移，實驗盡量使用低代次細(xì)胞（<20代），并記錄傳代次數(shù)。
實驗對照
設(shè)置空白對照組（僅培養(yǎng)基）和陰性對照組（正常肺上皮細(xì)胞，如BEAS-2B），排除非特異性干擾。
文獻(xiàn)速遞
A549最新研究熱點
腫瘤機(jī)制研究
聚焦KRAS通路下游信號（如RAF/MEK/ERK、PI3K/Akt/mTOR）的激活機(jī)制，探索耐藥相關(guān)分子（如BIM、MDR1）的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
藥物篩選
用于肺癌化療藥物（順鉑、紫杉醇）、靶向藥物（KRAS G12C抑制劑、MEK抑制劑）的體外藥效評估，結(jié)合藥敏實驗優(yōu)化用藥方案。
基因編輯模型
通過CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建特定基因敲除/敲入細(xì)胞系，研究抑癌基因（如p53、PTEN）的功能或驗證候選致癌基因。
腫瘤微循環(huán)模擬
與巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)，探究腫瘤-基質(zhì)細(xì)胞相互作用對侵襲轉(zhuǎn)移的影響，或構(gòu)建3D類器官模型模擬體內(nèi)腫瘤形態(tài)。
【CELLCOOK賽庫生物A549細(xì)胞系相關(guān)應(yīng)用文獻(xiàn)】
①Huang X, Zhang J, Cun Y, et al. Spatial control of m6A deposition on enhancer and promoter RNAs through co-acetylation of METTL3 and H3K27 on chromatin[J]. Molecular Cell, 2025, 85(7): 1349-1365. e10.（IF：16.6）
②Zhuang W, Liu C, Hong Y, et al. Tumor-suppressive miR-4732-3p is sorted into fucosylated exosome by hnRNPK to avoid the inhibition of lung cancer progression[J]. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research, 2024, 43(1): 123.（IF：12.8）
③Luo H, Liu L, Liu X, et al. Interleukin-33 (IL-33) promotes DNA damage-resistance in lung cancer[J]. Cell Death & Disease, 2025, 16(1): 274.（IF：9.6）
④Wang C, Wang C, Xiao C, Zhang W, Guo Y, Qu M, Song Q, Qi X, Zou B. Tumor-Selective Gene Therapy: Using Hairpin DNA Oligonucleotides to Trigger Cleavage of Target RNA by Endogenous flap endonuclease 1 (FEN 1) Highly Expressed in Tumor Cells. Small. 2025 May;21(20):e2410146. doi: 10.1002/smll.202410146. Epub 2025 Mar 28. PMID: 40156152.（IF：12.1）
⑤Cai D, Chen X, Xu H, et al. m5C-modified circRREB1 promotes lung cancer progression by inducing mitophagy[J]. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research, 2025, 44(1): 203.（IF：12.8）
⑥Xu H, Zhao Q, Cai D, et al. o8G-modified circKIAA1797 promotes lung cancer development by inhibiting cuproptosis[J]. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research, 2025, 44(1): 110.（IF：12.8）
⑦Yang Y, Yang Y, Huang H, et al. PLCG2 can exist in eccDNA and contribute to the metastasis of non-small cell lung cancer by regulating mitochondrial respiration[J]. Cell death & disease, 2023, 14(4): 257.（IF：9.6）
⑧Liu S, Zhang L, Ding K, et al. S. glabra exerts anti-lung cancer effects by inducing ferroptosis and anticancer immunity[J]. Phytomedicine, 2024, 134: 155981.（IF：8.3）
⑨Yang C, Li H X, Gan H, et al. KRAS4B oncogenic mutants promote non-small cell lung cancer progression via the interaction of deubiquitinase USP25 with RNF31[J]. Developmental cell, 2025.（IF：8.7）
⑩Wang J, Liu P, Zhang R, et al. VASH2 enhances KIF3C-mediated EGFR-endosomal recycling to promote aggression and chemoresistance of lung squamous cell carcinoma by increasing tubulin detyrosination[J]. Cell Death & Disease, 2024, 15(10): 772.（IF：9.6）
?Guo W, Ren Z, Huang X, et al. Single-molecule m6A detection empowered by endogenous labeling unveils complexities across RNA isoforms[J]. Molecular Cell, 2025, 85(6): 1233-1246. e7.（IF：16.6）
?Lv J, Chen J, Song Y, et al. Co-Delivery of VEGF siRNA and THPP via Metal–Organic Framework Reverses Cisplatin-Resistant Non-Small Cell Lung Cancer and Inhibits Metastasis through a MUC4 Regulating Mechanism[J]. ACS Applied Materials & Interfaces, 2024, 16(42): 56910-56925.（IF：8.2）
本文所述方法僅供參考，具體操作需結(jié)合實驗室條件優(yōu)化。
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