RAW264.7（小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞），是由加利福尼亞索爾克研究所的W. C. Raschke在雄性BAB/14小鼠腹腔注射A-MuLV（Abelson鼠科白血病病毒）誘發(fā)腫瘤的腹水中建立的，是最常見的炎癥細(xì)胞模型之一。RAW264.7細(xì)胞一般呈圓形，貼壁生長(zhǎng)（見圖1、圖2），具有較強(qiáng)的吞噬能力。在吞噬抗原后，細(xì)胞會(huì)釋放出趨化因子，促使分化，細(xì)胞伸出偽足，攀爬能力增強(qiáng)。在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，如果細(xì)胞吞噬抗原過(guò)多、培養(yǎng)方法不當(dāng)，會(huì)使細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的分化，呈現(xiàn)出梭形、長(zhǎng)梭形的形態(tài)。

圖1：RAW264.7正常形態(tài)

（100×）

圖2：RAW264.7正常形態(tài)

（200×）

細(xì)胞培養(yǎng)操作

 

 

細(xì)胞密度達(dá)80%時(shí)可使用細(xì)胞刮刀對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代分瓶處理。（勿用胰酶，胰酶易刺激RAW264.7細(xì)胞分化）

【操作步驟】：

1）吸出舊培養(yǎng)液，保留 2-3ml 培養(yǎng)液，使用無(wú)菌細(xì)胞刮刀沿著同一方向輕柔刮拭細(xì)胞（不要來(lái)回刮拭，容易破壞細(xì)胞膜導(dǎo)致細(xì)胞死亡）

2）收集刮落的細(xì)胞，離心（1000rpm,5min），棄上清。

3）重懸后按1:2~1:4比例傳代（首次傳代建議1:2），接種至含新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中。

收到細(xì)胞后可于傳代培養(yǎng)穩(wěn)定2-3代開始凍存，建議邊培養(yǎng)邊凍存留種。

【常規(guī)凍存步驟】：

1）用細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞，1000 rpm離心5分鐘，棄上清。

2）用凍存液（DMEM高糖 + 10% FBS + 10% DMSO）重懸，密度達(dá)70%可凍存一管（或以1×10?~5×10? cells/mL的密度重懸）。

3）分裝至凍存管（1 mL/管），4℃平衡15-30分鐘 → 轉(zhuǎn)入程序凍存盒（-1℃/min降溫）→ -80℃過(guò)夜 → 液氮長(zhǎng)期保存。

【無(wú)血清凍存液（可選）】：

使用無(wú)血清凍存液（CellCook cat：CM1004SF）可省去程序降溫步驟，直接轉(zhuǎn)入-80℃保存，但仍建議放置24小時(shí)后再轉(zhuǎn)移至液氮。

無(wú)血清凍存液使用方法與使用效果參考→【無(wú)血清凍存液PK常規(guī)凍存液】

1）37℃水浴快速融化凍存管（1分鐘內(nèi)），剩余少量冰晶時(shí)停止搖晃。

2）將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含4-6 mL完全培養(yǎng)基的離心管中，混勻。

3）1000 rpm離心5分鐘，棄上清，用完全培養(yǎng)基重懸。

4）接種至含6-8 mL培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，37℃、5% CO?培養(yǎng)過(guò)夜，次日觀察細(xì)胞狀態(tài)。

培養(yǎng)要點(diǎn)&注意事項(xiàng)

 

 

正常狀態(tài)下，RAW264.7呈圓形或少量梭形。這株細(xì)胞很容易分化，培養(yǎng)時(shí)注意觀察細(xì)胞形態(tài)，培養(yǎng)環(huán)境惡劣或吞噬過(guò)多抗原后會(huì)促使該細(xì)胞呈現(xiàn)梭形、長(zhǎng)梭形，形態(tài)發(fā)生變化。在培養(yǎng)過(guò)程中是無(wú)法保證100%不分化（由于細(xì)胞相對(duì)敏感細(xì)胞群中出現(xiàn)個(gè)別長(zhǎng)觸角分化的細(xì)胞為正?，F(xiàn)象，不影響整體細(xì)胞活力生長(zhǎng)可繼續(xù)觀察培養(yǎng)），可通過(guò)傳代操作將分化比例控制在一定范圍內(nèi)，吹打細(xì)胞時(shí)輕柔一些，吹打過(guò)于用力也會(huì)刺激分化。當(dāng)出現(xiàn)較多分化細(xì)胞時(shí)可根據(jù)細(xì)胞情況選擇將上層圓潤(rùn)未分化細(xì)胞輕輕吹下收集換瓶培養(yǎng)，下層貼壁牢固的分化細(xì)胞可直接淘汰丟棄。若分化細(xì)胞比例＞30%，建議棄用并復(fù)蘇新批次。

避免刺激因素：血清質(zhì)量差、胰酶消化、吹打過(guò)猛、傳代間隔過(guò)長(zhǎng)均可能誘導(dǎo)分化。

貼壁性差：RAW264.7細(xì)胞有聚團(tuán)生長(zhǎng)特性，貼壁性相比一般貼壁細(xì)胞會(huì)差一些。細(xì)胞密度過(guò)高或pH偏低時(shí)易脫落，可收集漂浮細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)。

聚團(tuán)處理：該細(xì)胞本身有聚團(tuán)生長(zhǎng)特性，正常培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞會(huì)成片成團(tuán)生長(zhǎng)，若細(xì)胞嚴(yán)重聚團(tuán)可更換優(yōu)質(zhì)血清批次、輕柔吹打分散，或提高傳代頻率（密度達(dá)70%即傳代）。

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