ATP 生物發(fā)光技術(shù)的原理是熒光素酶以熒光素、三磷酸腺苷(ATP)和O2為底物，在Mg2+ 存在時(shí)，能將化學(xué)能轉(zhuǎn)化為光能。ATP既是熒光素酶催化發(fā)光的必需底物，又是所有生物生 命活動(dòng)的能量來源。在熒光素酶催化的發(fā)光反應(yīng)中，ATP在一定的濃度范圍內(nèi)，其濃度與發(fā) 光強(qiáng)度呈線性關(guān)系。



      本試劑盒采用生物發(fā)光(bioluminescent)法，利用Firefly luciferase(螢火蟲熒光素酶)催化 底物——熒光素的轉(zhuǎn)化，高效利用ATP的能量，發(fā)射出光子。發(fā)光信號與存在的ATP量呈 正比，而ATP與存在于培養(yǎng)基中的細(xì)胞數(shù)目直接呈正比。

      本試劑盒為多孔板而設(shè)計(jì)，是進(jìn)行自動(dòng)化高通量篩選(HTS)，類器官或細(xì)胞增殖和毒性 分析的理想選擇。均質(zhì)檢測步驟就是將單一試劑直接加入類器官或細(xì)胞培養(yǎng)液中，無需去 膠，洗滌細(xì)胞、去除培養(yǎng)基或進(jìn)行多步加樣操作。

     

     均質(zhì)檢測的"加樣-混合-檢測"的操作方案使得類器官或細(xì)胞裂解和產(chǎn)生的發(fā)光信號與存 在的ATP量成正比，而ATP量直接與培養(yǎng)物中的細(xì)胞數(shù)量成正比。獨(dú)特的均質(zhì)檢測方案避 免了那些需要多個(gè)步驟的ATP檢測方法可能會引入的誤差。





操作步驟

1. 類器官或細(xì)胞的準(zhǔn)備：

使用適合進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測的96孔板，每孔接種5ul-10ul類器官或100μl 細(xì)胞（如使用 384 孔板，每孔接種2.5μl-4μl類器官或25μl 細(xì)胞，具體用量視不同類型的384 孔板而定）， 并確保檢測時(shí)每孔的細(xì)胞數(shù)量在5萬個(gè)以內(nèi)（如使用384孔板宜控制在1萬個(gè)以內(nèi)），同時(shí) 設(shè)置不含類器官或細(xì)胞的培養(yǎng)液孔作為陰性對照，按照類器官或細(xì)胞培養(yǎng)的常規(guī)方法培養(yǎng) 細(xì)胞。如有需要，可加入藥物處理細(xì)胞。此外，如有必要，也可以設(shè)置細(xì)胞的濃度梯度， 以便后續(xù)確定試劑盒的使用效果。

2. 檢測試劑的準(zhǔn)備：

2.1試劑準(zhǔn)備

10 mLkit : 每瓶凍干粉添加10mlbuffer混勻避光待用

a. 溶解CellTiter-JFKR-Organoid 發(fā)光法檢測試劑，如有必要可適當(dāng)分裝該試劑。

b. 按照96 孔板每孔接種5ul-10ul類器官或100μl 細(xì)胞 (384 每孔接種2.5μl類器官或25μl 細(xì) 胞) 的量，取適量CellTiter-JFKR-Organoid 發(fā)光法檢測試劑，平衡至室溫。

3. 類器官或細(xì)胞活力檢測：

a. 取出細(xì)胞培養(yǎng)板在室溫平衡10分鐘(通常不宜超過30分鐘)。

b. 96 孔板每孔加入100μlCellTiter-JFKRCell 發(fā)光法檢測試劑(384 孔板每孔25μl)。

c. 室溫振蕩2分鐘，以促進(jìn)類器官或細(xì)胞的裂解。

d. 室溫(約25℃)孵育10 分鐘，使發(fā)光信號趨于穩(wěn)定。

e. 使用具有檢測化學(xué)發(fā)光功能的多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測。請根據(jù)儀器要求設(shè)置相 應(yīng)的參數(shù)，每個(gè)孔的檢測時(shí)間一般為0.25-1秒或更長時(shí)間，具體需根據(jù)儀器的檢測靈敏度 進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。

f. 根據(jù)化學(xué)發(fā)光讀數(shù)直接計(jì)算類器官或細(xì)胞的相對活力，或根據(jù)ATP標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出ATP 的量從而計(jì)算出細(xì)胞的相對活力。

注：檢測效果因類器官或細(xì)胞的種類不同而有所不同，對于一些ATP含量特別高的細(xì)胞， 在細(xì)胞數(shù)量達(dá)到50,000 個(gè)后可能會不呈線性相關(guān)，但化學(xué)發(fā)光讀數(shù)還是會繼續(xù)升高。

注意事項(xiàng)
1、熒光素酶的活性對溫度比較敏感，所以反應(yīng)前類器官或細(xì)胞和檢測試劑均需平衡至室溫后再進(jìn)行測定。檢測試劑請混勻后使用。
2 、本試劑盒的檢測試劑中含有熒光素酶，反復(fù)凍融會導(dǎo)致其逐漸失活。為取得良好的使用
效果，第一次溶解后后可適當(dāng)分裝保存，但需注意分裝的容器不能有ATP污染。
3 、待測藥物的溶劑含量較高時(shí)可能會干擾熒光素酶反應(yīng)，從而影響化學(xué)發(fā)光信號?？梢酝?br>過設(shè)置含有溶劑的類器官或細(xì)胞培養(yǎng)液對照孔排除溶劑的干擾。
4、檢測時(shí)須使用適合于細(xì)胞培養(yǎng)的白色或黑色的96孔板或384孔板。如果使用普通透明的
96 孔板或384 孔板，相鄰孔之間會產(chǎn)生相互干擾。
5、本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
6、為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。